規範環境下(xià)色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性控制

爲确保對(duì)色譜峰進行正确的(de)測量（或積分(fēn)），需要分(fēn)析人(rén)員(yuán)對(duì)積分(fēn)結果進行準确性和(hé)一緻性判斷。在大(dà)多(duō)數情況下(xià)，人(rén)爲參與的(de)過程往往會導緻判斷結果受到非客觀标準的(de)影(yǐng)響。所以色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性尤爲重要，這(zhè)也(yě)是監管機構的(de)審查重點，這(zhè)篇文章(zhāng)我們将簡要討(tǎo)論如何對(duì)色譜積分(fēn)進行合理(lǐ)合規性控制。

1       簡介

高(gāo)效液相色譜（HPLC）和(hé)氣相色譜（GC）是現代分(fēn)析實驗室中最常用(yòng)的(de)技術。這(zhè)兩種技術的(de)專屬性、靈敏度和(hé)靈活性使其适用(yòng)于廣泛的(de)樣品基質中絕大(dà)多(duō)數被分(fēn)析物(wù)的(de)測定。這(zhè)兩種技術的(de)原始輸出都是信号強度對(duì)比時(shí)間的(de)曲線圖，通(tōng)常稱爲色譜圖。色譜圖中的(de)各個(gè)峰分(fēn)别對(duì)應于樣品中的(de)各個(gè)成分(fēn)，而峰面積通(tōng)常正比于樣品中相應成分(fēn)的(de)濃度。

要定量樣品中的(de)被分(fēn)析物(wù)濃度，就需要對(duì)色譜圖進行積分(fēn)以測量峰的(de)面積。現代高(gāo)效液相色譜法和(hé)氣相色譜儀配備的(de)電腦(nǎo)色譜數據采集和(hé)處理(lǐ)系統，都具備自動化(huà)積分(fēn)的(de)功能，分(fēn)析人(rén)員(yuán)需要做(zuò)的(de)主要是設定适當的(de)積分(fēn)參數（例如：斜率靈敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值，峰高(gāo)阈值，撇去率等），軟件将依據這(zhè)些參數來(lái)對(duì)各個(gè)色譜峰進行确認和(hé)積分(fēn)。

2       監管要求

由于分(fēn)析人(rén)員(yuán)可(kě)以根據自己的(de)主觀判斷人(rén)爲地設定積分(fēn)參數，無論在常規審查或藥品生産上市授權評估過程中，對(duì)色譜峰正确和(hé)精确的(de)積分(fēn)及其過程都是重點審核内容。

從美(měi)國FDA對(duì)藥企發布的(de)警告信中，可(kě)以看到關于色譜積分(fēn)的(de)一些更加具體化(huà)的(de)要求：

• 不允許采用(yòng)手動積分(fēn)。

• 需要開啓色譜軟件的(de)審計跟蹤功能，并将包含積分(fēn)參數的(de)分(fēn)析方法和(hé)原始數據一同保存，以确保方法的(de)積分(fēn)參數修改曆史可(kě)追溯。

• “更改積分(fēn)參數，以得(de)到好的(de)積分(fēn)結果”是不可(kě)接受的(de)。在審查過程中，沒有合理(lǐ)解釋的(de)多(duō)次重新積分(fēn)被認爲是企圖人(rén)爲操縱峰面積以獲得(de)合格的(de)結果。

• 方法一旦經過驗證且被用(yòng)于藥品的(de)常規QC放行，對(duì)後續每個(gè)色譜數據的(de)積分(fēn)都需要使用(yòng)該方法以确保一緻性。FDA當前的(de)期望實際上是傾向于将色譜方法“鎖定”以保證始終使用(yòng)同樣的(de)積分(fēn)參數。

綜合來(lái)講，色譜峰的(de)積分(fēn)、積分(fēn)參數的(de)設定和(hé)驗證、積分(fēn)參數的(de)修改和(hé)再驗證等都要遵循科學合理(lǐ)的(de)過程，并通(tōng)過标準操作規程（SOP）或類似的(de)文件進行控制。

3       控制色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性

那麽，要怎樣控制色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性呢(ne)？我們分(fēn)以下(xià)幾個(gè)小節來(lái)探討(tǎo)。

3.1      通(tōng)用(yòng)積分(fēn)過程及參數

爲了(le)對(duì)積分(fēn)參數進行設定，有必要了(le)解色譜數據處理(lǐ)程序是如何進行積分(fēn)的(de)。這(zhè)裏将嘗試討(tǎo)論一個(gè)通(tōng)用(yòng)的(de)過程，不同的(de)色譜數據處理(lǐ)系統可(kě)能在細節上有所不同。

色譜積分(fēn)過程包括下(xià)列事件：

    •  确定初始基線

首先取第一數據點作爲一個(gè)暫定基線點。然後積分(fēn)器取一定數據點的(de)平均值重新定義初始基線點。用(yòng)作取平均值的(de)數據點數是由峰寬函數決定的(de)。在确立了(le)的(de)新的(de)基線點前，第一數據點被取作初始基線點。

    •  連續追蹤和(hé)更新基線

随著(zhe)積分(fēn)器不斷錄入新的(de)數據點，基線點需要向後推移并更新。被接納爲基準點，一個(gè)數據點必須符合以下(xià)條件：

  •  它必須在所指定的(de)由斜率阈值決定的(de)基線阈值内

  •  基線的(de)曲率必須低于由斜率阈值确定的(de)阈值

  •  累積總和(hé)不能超過指定的(de)面積阈值

基線以由峰寬值決定的(de)速率不斷重置，直到檢測出色譜峰。

    •  色譜峰開始時(shí)間的(de)識别和(hé)确認

當新錄入的(de)數據點超出基線阈值，并且基線曲率超過由斜率靈敏度函數确定的(de)設定值，即辨别出一個(gè)潛在的(de)色譜峰。如果接下(xià)來(lái)的(de)數據點保持上升，并滿足下(xià)列條件，積分(fēn)器即識别出一個(gè)潛在的(de)色譜峰開始時(shí)間。

  •  斜率和(hé)曲率超過由基線阈值确定的(de)限值

  •  連續的(de)數據點之間的(de)差值超過噪聲阈值

潛在的(de)色譜峰開始時(shí)間被确認的(de)條件需要符合下(xià)列标準：

  •  斜率繼續超過由基線阈值确定的(de)限制

  •  累計面積超出峰面積阈值

  •  曲率變爲負值形成前拐點

    •  色譜峰頂點的(de)确認

峰頂點的(de)确認需要滿足下(xià)列條件：

  •  斜率通(tōng)過零點并變爲負值

  •  曲率變爲正值

  •  後續數據點的(de)值降低，且該數據點與後續3個(gè)數據點的(de)峰面積差累計超過2/3的(de)峰面積阈值。

    •  色譜峰終點的(de)識别和(hé)确認

色譜峰潛在終點的(de)識别條件：

  •  斜率和(hé)曲率回落到由基線阈值确定的(de)限值内

  •  兩個(gè)連續的(de)數據點之間的(de)差值小于5倍噪聲阈值

    •  色譜峰終點的(de)确認條件：

  •  斜率和(hé)曲率保持在基線阈值确定的(de)限值内

  •  在方法建立過程中，依據不同參數對(duì)色譜積分(fēn)事件的(de)作用(yòng)進行各參數（斜率靈敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值，峰高(gāo)阈值等）的(de)設定。

3.2      未完全分(fēn)離色譜峰

對(duì)于色譜峰的(de)最準确的(de)積分(fēn)要求所有的(de)峰完全分(fēn)離。如有某些需要精确定量測定的(de)峰沒有完全分(fēn)離，首先需要優化(huà)色譜分(fēn)離條件。在經過大(dà)量努力後還(hái)是不能獲得(de)充分(fēn)分(fēn)離的(de)情況下(xià)，可(kě)以考慮通(tōng)過合理(lǐ)的(de)積分(fēn)獲取未分(fēn)離組分(fēn)相對(duì)的(de)準确峰面積。

如果定量數據必須從未分(fēn)離峰獲得(de)，需要制定明(míng)确的(de)規定，以便确定未分(fēn)離峰應該如何積分(fēn)。這(zhè)樣的(de)規定應該包含在什(shén)麽情況下(xià)可(kě)以使用(yòng)什(shén)麽功能對(duì)未分(fēn)離色譜峰進行積分(fēn)，這(zhè)些功能包括：

  •  切線撇去

  •  指數撇去

  •  指數曲線拟合

  •  直線撇去

  •  前伸峰撇去

  •  拖尾峰撇去

  •  峰谷比

  •  谷高(gāo)比

  •  谷垂直切分(fēn)

3.3      積分(fēn)效果的(de)基本要求

進行合理(lǐ)合規的(de)積分(fēn)需要明(míng)确怎樣才算(suàn)是适當和(hé)準确的(de)積分(fēn)。筆者認爲原則性的(de)标準應該是“不多(duō)不少”地積分(fēn)。

爲使同一實驗室内不同分(fēn)析人(rén)員(yuán)有一個(gè)統一的(de)标準，建議(yì)在書(shū)面文檔中用(yòng)圖表來(lái)說明(míng)什(shén)麽是可(kě)接受的(de)色譜峰，什(shén)麽是不可(kě)接受的(de)色譜峰。如圖2，其中峰A表示可(kě)接受的(de)積分(fēn)峰；而峰B是不可(kě)接受的(de)峰積分(fēn)，因爲峰的(de)拖尾部分(fēn)未被完全積入； 峰C也(yě)是不可(kě)接受的(de)，因爲将可(kě)能是基線漂移的(de)區(qū)域積進去了(le)。

3.4      積分(fēn)參數的(de)設定和(hé)驗證

在做(zuò)主成分(fēn)測定時(shí)，數據處理(lǐ)方法的(de)控制相對(duì)容易。但是當涉及到有關物(wù)質測定時(shí)，數據處理(lǐ)方法的(de)開發和(hé)控制有時(shí)候是非常具有挑戰性的(de)。建議(yì)在方法學的(de)準确度和(hé)精密度驗證部分(fēn)，專門考察改變積分(fēn)參數對(duì)最終結果的(de)影(yǐng)響。可(kě)以使用(yòng)在回收率實驗中獲得(de)的(de)原始數據，對(duì)下(xià)面的(de)主要積分(fēn)參數進行系統化(huà)地測試（不同的(de)數據處理(lǐ)軟件可(kě)能有不同的(de)參數）：

• 斜率靈敏度

• 峰寬阈值

• 峰高(gāo)阈值

• 面積阈值

• 噪聲阈值

記錄并評估這(zhè)些參數的(de)改變對(duì)回收率計算(suàn)結果的(de)影(yǐng)響，并在滿足回收率标準（通(tōng)用(yòng)标準爲98.0~102.0%）的(de)參數組合中選擇居中的(de)參數組合，以便獲得(de)更好的(de)方法耐用(yòng)性。後續出現分(fēn)析結果異常（如出現新的(de)未知雜(zá)質）需要重新設定積分(fēn)參數時(shí)，這(zhè)些對(duì)參數改變的(de)研究數據，也(yě)可(kě)以爲參數的(de)可(kě)修改範圍提供依據。

3.5      特殊情況下(xià)積分(fēn)參數的(de)重新設定和(hé)驗證

分(fēn)析人(rén)員(yuán)有時(shí)候會遇到一些特殊情況。比如，一個(gè)通(tōng)過驗證的(de)方法，在常規分(fēn)析時(shí)完全沒有問題，但在穩定性測試期間，有時(shí)候後會有新的(de)色譜峰、峰型改變、共洗脫峰等異常情況，這(zhè)種情況下(xià)往往原來(lái)的(de)分(fēn)析方法不再适用(yòng)。

如果是已上市藥品出現了(le)上述異常情況，表示這(zhè)些産品可(kě)能不符合規範，并應啓動實驗室和(hé)生産調查，以表征雜(zá)質，并确定其來(lái)源。這(zhè)種情況一旦經過确認，企業需要從市場(chǎng)上召回産品，因爲一個(gè)産品降解特性的(de)鑒定是銷售許可(kě)的(de)先決條件。

在另一方面，如果異常情況出現在産品開發的(de)早期階段，同樣需要表征雜(zá)質和(hé)确定其來(lái)源。這(zhè)時(shí)候分(fēn)析人(rén)員(yuán)可(kě)能需要修改數據處理(lǐ)方法或者整個(gè)分(fēn)析方法并重新驗證。這(zhè)種情況在藥物(wù)研發的(de)早期階段經常發生，可(kě)以說分(fēn)析方法驗證應被視爲一個(gè)過程，而非一次性的(de)工作。

4       結論意見

色譜峰的(de)積分(fēn)是在現代分(fēn)析實驗室中最經常執行的(de)活動之一。爲了(le)獲得(de)一緻的(de)結果，每次分(fēn)析數據的(de)積分(fēn)都需要使用(yòng)相同的(de)方式。正是出于這(zhè)個(gè)原因，我們建議(yì)實驗室建立适當的(de)規範和(hé)标準操作程序，爲準确和(hé)科學的(de)積分(fēn)提供明(míng)确的(de)依據。

此外，應該建立明(míng)确的(de)程序，規範方法開發和(hé)驗證階段的(de)積分(fēn)參數選擇和(hé)驗證。而經核準的(de)書(shū)面方法應該包括合适的(de)色譜積分(fēn)參數，并指定允許分(fēn)析人(rén)員(yuán)在必要的(de)異常情況下(xià)作出适當調整的(de)範圍。一個(gè)方法一旦經過驗證且被使用(yòng)，之後對(duì)每個(gè)色譜數據的(de)積分(fēn)都需要用(yòng)這(zhè)個(gè)方法以确保使用(yòng)相同的(de)參數。而出現異常情況對(duì)方法做(zuò)出調整後，需要重新驗證并對(duì)異常事件根源進行調查和(hé)合理(lǐ)的(de)解釋。